摘要
目的
检测血清肿瘤标志物甲胎蛋白(AFP)、糖类抗原199(CA-199)和癌胚抗原(CEA)在大鼠肝癌模型和老年肝癌患者中的表达水平，并分析其临床意义。
方法
通过小剂量二乙基亚硝胺(DEN)腹腔注射的方法，成功建立了大鼠肝癌模型，对血清AFP、CA-199和CEA在大鼠肝癌发生过程中的表达进行比较分析；同时收集健康老年人和肝癌老年患者各80例的血液标本，对血清AFP、CA-199和CEA在健康老年人和肝癌老年患者中表达进行比较分析。
结果
与正常大鼠比较，肝癌大鼠的血清AFP、CA-199和CEA分别为(4.21±1.32)μg/L、(3.78±1.04)kU/L、(3.54±0.92)μg/L，与对照组大鼠(1.05±0.33)μg/L、(1.00±0.28)kU/L、(1.10±0.37)μg/L比较，均出现明显上调(t＝9.493、8.609、7.675，P＝0.000、0.000、0.000)。肝癌组80例老年肝癌患者的血清AFP、CA-199和CEA分别为(66.89±9.33)μg/L、(116.89±43.33)kU/L、(5. 83 ± 1. 56)μg/L，与对照组同期健康的老年体检者(2.56±1.09)μg/L、(5.56±1.26)kU/L、(1. 17 ± 0.51)μg/L比较，均出现上调(t＝14.379、17.470、10.677，P＝0.000、0.000、0.000)；肝癌组AFP、CA-199和CEA联合检测的阳性率为77.50%(62例)，高于对照组1.25%(1例)(χ2＝17.260，P＝0.000)。
结论
血清AFP、CA-199和CEA联合检测有助于提高肝癌阳性检出率。
目前，60岁及以上老年人群已成为肝癌疾病的主要受累群体。肝癌的起病隐匿，进展迅速，早期诊断、早期治疗已经成为提高肝癌患者生存率的关键[1,2,3]。随着分子生物学技术的不断发展，肿瘤标志物的动态监测对肿瘤的早期诊断和治疗提供了帮助。但由于目前临床上多以单一血清标志物作为肝癌血清诊断的指标，其在诊断的时间和敏感度上均无显著优势，而采用多个血清标志物联合检测是提高肝癌诊断灵敏度和准确度的方法，但选择哪几种血清标志物对肝癌进行诊断是临床医生亟待解决的问题。肿瘤标志物甲胎蛋白(AFP)是针对原发性肝癌诊断的重要标志物，但单一的AFP并不能完全反应病情变化，因此应联合其他血清标志物；糖类抗原-199(CA-199)是另一种常见的肿瘤标志物，其在多种消化系统肿瘤中均会升高[4,5,6]；癌胚抗原(CEA)是首先在结肠癌患者血清中发现的一种糖蛋白，大量的研究已经证实，CEA在多种类型的肿瘤疾病中均有所升高[1]。CA-199和CEA两种血清标志物在原发性肝癌患者血清中的浓度值可特异性增高，故以AFP为主，CA-199和CEA为辅对原发性肝癌进行血清标志物联合监测是可靠筛查手段。为了模拟人类肝癌的发生过程，国内外学者已尝试建立了动物肝癌模型，以便在更大程度上辅助临床研究，成功的动物模型包括小鼠、大鼠、仓鼠、猪等[7,8]。其中，二乙基亚硝胺(DEN)诱导大鼠肝癌模型就是一种经典的肝癌动物模型。本研究采用这种模型结合临床老年肝癌患者对上述3种肿瘤标志物进行了联合诊断，旨在进一步完善了肝癌的筛查手段。
对象和方法
一、对象
纳入符合肝癌诊断标准，年龄均超过60岁，可配合完成试验的临床资料完整患者。选取2013年1月至2014年12月经病理学诊断的80例在我院住院的老年肝癌患者，年龄61～78岁，平均(70.1±5.2)岁，其中男性47例、女性33例，平均体质量(60.4±5.8)kg，临床诊断标准符合中国抗癌协会肝癌专业委员会2011年修订的原发性肝癌诊断标准[9]，且经B超和CT确诊；同时选取80例同期健康体检的老年人作为对照组，年龄60～80岁，平均(69.8±4.9)岁，其中男性43例、女性37例，平均体质量(61.3±6.1)kg，抽取两组患者的静脉血4～5 ml用于后续检测。排除未能完成试验者或临床资料不完整者，所有患者均签署知情同意书。两组患者的年龄、性别、体质量的差异均无统计学意义，基本资料具有可比性(均P>0.05)。
二、方法
1．动物模型的建立：
选购50只健康的清洁级雄性F344大鼠，10～12周龄，体质量150～210 g。所有大鼠随机分为正常对照组(20只)和试验组(30只)，给予试验组大鼠腹腔DEN注射，3 d 1次，至第12周时停药，对照组给予腹腔注射相同剂量和频率的生理盐水，试验过程中观察实验动物的一般情况变化。第12周后，给予0.75%戊巴比妥钠腹腔注射麻醉，开腹后腹主动脉取血，每只取4～5 ml。观察肝脏大体情况后，取出肝脏进行苏木精-伊红(HE)染色，对模型的建立进行验证。
2．血液检测：
将选取的患者或大鼠的血液进行血清分离并检测，用罗氏电化学发光免疫分析仪检测血清甲胎蛋白(AFP)、糖类抗原199(CA-199)和癌胚抗原(CEA)水平，操作步骤严格按试剂盒说明书进行。
3．检测指标及结果判断：
人类参考范围：AFP<25 μg/L，CA-199<40 kU/L，CEA<5.9 μg/L[10]。
三、统计学方法
运用SPSS17.0统计软件进行数据分析，计量资料以±s表示，两组比较采用t检验，计数资料以百分比或率表示，采用χ2检验；以P<0.05为差异有统计学意义。
结果
一、大鼠肝癌模型的组织病理学验证
大鼠肝癌模型组织切片镜下可见DEN处理12周后，对照组大鼠肝细胞无变性、坏死，肝小叶结构正常，肝条索排列规整，以中央静脉为中心呈放射状排列(图1)；试验组大鼠在肝硬化的基础上出现肝癌结节生成，肝细胞异型性明显，细胞核分裂较多，可见病理性核分裂相，显示出明显的肝癌特征(图2)。
图1～2 分别为DEN处理12周后对照组和试验组大鼠肝癌模型的组织病理学特征 HE染色 ×200
二、大鼠肝癌模型血清肿瘤标志物的表达
与正常大鼠比较，肝癌大鼠的血清AFP、CA-199和CEA分别为(4.21±1.32)μg/L、(3.78±1.04)kU/L、(3.54±0.92)μg/L，与对照组大鼠(1.05±0.33)μg/L、(1.00±0.28)kU/L、(1.10±0.37)μg/L比较，均出现明显上调，且差异均具有统计学意义(t＝9.493、8.609、7.675，P＝0.000、0.000、0.000)。
三、老年患者血清肿瘤标志物水平
肝癌组80例老年肝癌患者的血清AFP、CA-199和CEA分别为(66.89±9.33)μg/L、(116.89±43.33)kU/L、(5. 83 ± 1. 56)μg/L，与对照组同期健康的老年体检者(2.56±1.09)μg/L、(5.56±1.26)kU/L、(1. 17 ± 0.51)μg/L比较，均出现上调，差异均具有统计学意义(t＝14.379、17.470、10.677，P＝0.000、0.000、0.000)。
四、老年患者血清肿瘤标志物阳性例数及阳性率
肝癌组80例老年肝癌患者的血清AFP、CA-199和CEA检测阳性率分别为63.75%(51例)、23.75%(19例)和28.75%(23例)，AFP、CA-199和CEA联合检测的阳性率为77.50%(62例)；而对照组80例患者血清AFP、CA-199和CEA检测阳性率分别为1.25%(1例)、0.00%(0例)和1.25%(1例)，AFP、CA-199和CEA联合检测的阳性率为1.25%(1例)，肝癌组联合检测的阳性例数和阳性率均显著高于对照组，差异具有统计学意义(χ2＝17.260，P＝0.000)。
讨论
原发性肝癌是在中国乃至世界范围内的一种高发生率和高致死率的恶性肿瘤[11]，老年患者是其主要的受累群体，此类疾病一般合并肝硬化，治愈率较低，其5年生存率一般低于10%。由于肝癌的起病隐匿，不易早期诊断，大多数肝癌患者在发现疾病时已是中晚期，因此，早期发现、早期治疗成为提高患者生存率的首要任务。肿瘤标志物是在肿瘤细胞发生、发展和增殖过程中由肿瘤细胞本身合成或分泌的一类物质[12,13]，其在肿瘤的诊断、分类和预后中发挥着十分重要的作用，一般而言，肿瘤标志物水平越高，病程越晚，则疾病的预后越差。肿瘤标志物在血清中的含量与相应肿瘤的发生和发展具有一定的相关性，因此，肿瘤标志物对于肿瘤的早期诊断、治疗和预后有极其重要的意义。随着分子生物学技术的不断发展，人们发现了越来越多的血清肿瘤标志物，肿瘤标志物的动态监测对肿瘤的早期诊断和治疗提供了帮助。但是，由于临床上多以单一血清标志物作为肝癌血清诊断的指标，不仅在诊断的时间上无显著优势，也容易造成早期疾病诊断的错漏，因而已成为肝癌诊断和治疗的一大难题。面对日益增多的肿瘤标志物，选择最有效且具有肿瘤特异性的肿瘤标志物已成为临床实践中富有挑战性的工作。
为了模拟人类肝癌的发生过程，我们建立了经典的DEN诱导大鼠肝癌模型[14,15]。本研究采用这种模型结合临床老年肝癌患者病例对多种肿瘤标志物进行了联合诊断，完善了肝癌的筛查手段。我们通过小剂量DEN腹腔注射的方法，成功建立了大鼠肝癌模型，对血清AFP、CA-199和CEA在大鼠肝癌发生过程中的表达进行比较分析；同时，收集健康老年人和肝癌老年患者的血液标本，对血清AFP、CA-199和CEA在健康老年人和肝癌老年患者中表达进行比较分析。我们的结果显示：(1)与正常大鼠比较，肝癌大鼠的血清AFP、CA-199和CEA出现明显上调；(2)血清AFP、CA-199和CEA在老年肝癌患者中出现上调；(3)老年肝癌患者的血清AFP、CA-199和CEA联合检测相对于健康对照组阳性率显著增高。
综上所述，我们在动物学实验和临床均证实，肝癌发生时，血清AFP、CA-199和CEA的水平出现升高，且AFP、CA-199和CEA联合检测比任1项肿瘤标志物的单一检测更有助于提高肝癌阳性的检出率。因此，3种肿瘤标志物的联合检测可以避免使用单一肿瘤标志物诊断肝癌时容易出现的漏诊，也可以避免更多类型肿瘤标志物同时检测给患者带来的不必要的经济负担。AFP、CA-199和CEA联合检测可以在患者经济负担的范围内有效提高肝癌的诊断效率，这提示我们，肿瘤标志物AFP、CA-199和CEA的联合检测可用于为肝癌的早期诊断、治疗和预后提供重要的参考价值。
